Detaillierte Projektbeschreibung

Projektziele & Forschungsansatz

Projektziel

Ziel ist es, innerhalb der Projektdauer nachweisen zu können, dass nach durchgeführter bakterieller Typisierung in einem klinisch akzeptablen, bis zu 2-wöchigen Zeitraum wirksame Bakteriophagen anziehbar und vermehrbar sind und eine Therapie erfolgreich begonnen werden kann. Damit soll die Praktikabilität der Phagentherapie unter den heute in der BRD bereits zur Verfügung stehenden infrastrukturellen Bedingungen und unter Berücksichtigung der gesetzlichen Vorgaben nachgewiesen werden. Es könnte gezeigt werden, dass eine individuelle, auf die Patientensituation angepasste Phagentherapie bei adäquater Indikation (Multiresistenz) tatsächlich bereits heute, auch in Deutschland, in den stationären Versorgungsalltag implementiert werden könnte (personalisierte Infektbehandlung).

Forschungsansatz

Das Projekt PhagoFlow widmet sich dem Problem in Form einer Praktikabilitätstestung patientenspezifisch individuell hergestellter „Cocktails“ von Phagen, die gegen betreffende Bakterien wirken sollen. Dabei wird die Apotheke des Bundeswehrkrankenhauses Berlin die Phagen-„Cocktails“ auf ärztliche Anordnung für den Einzelfall mischen. Unabdingbare Voraussetzungen für Therapie mit lytischen Phagen sind: Sie müssen biologisch gut charakterisiert und effizient sein, d.h. ein breites Spektrum an Bakterienstämmen innerhalb einer Bakterienart abdecken (lysieren) und sie müssen gemäß Arzneimittelgesetz Sicherheits- und Reinheitskriterien erfüllen. Auf dieser Basis werden Sammlungen sich im Wirtsspektrum ergänzender Phagen für besonders häufig multiresistente Bakterienarten am Leibniz-Institut DSMZ zusammengestellt, sodass sie zur pharmazeutischen Aufreinigung an das Fraunhofer Institut ITEM weitergegeben werden, dort werden sie unter GMP-Bedingungen, Good Manufacturing Practice, als pharmazeutische Wirkstoffe hergestellt und der Apotheke des Bundeswehr-Krankenhauses Berlin zur Verfügung gestellt. Patienten werden nach einem durchgeführten Phagogramm mehrere passende Phagen erhalten, die gemeinsam möglichst synergistisch wirken sollen. Das Phagogramm gibt im Einzelfall Aufschluss über das Spektrum wirksamer Phagen. Damit wird eine individualisierte Therapie gegen multiresistente Bakterien durch PhagoFlow in Deutschland umgesetzt.

Magistrale Anwendung

Warum PhagoFlow keine klinische Studie ist

Versorgungsforschung ist ein Teilgebiet der Gesundheitssystemforschung, das im Grenzbereich von Klinischer Forschung, Public Health-Forschung und Gesundheitsökonomie liegt. Gegenstand der Versorgungsforschung ist die Beantwortung allgemeingültiger Fragestellungen der Kranken- und Gesundheitsversorgung.

Unter wissenschaftlichen Gesichtspunkten wird Versorgungsforschung als eine grundlagen- und problemorientierte, fachübergreifende Forschung definiert, welche die Kranken- und Gesundheitsversorgung und ihre Rahmenbedingungen beschreibt, kausal erklärt und aufbauend darauf Versorgungskonzepte entwickelt, deren Umsetzung begleitend erforscht und unter Alltagsbedingungen evaluiert.

Unser PhagoFlow Projekt dient innerhalb dieser Versorgungsforschung der Nutzenbewertung einer neuen Therapieform mit Bakteriophagen für die zukünftige Einführung in den Bereich der krankenversicherten Patientinnen und Patienten.

Im Gegensatz dazu beschäftigen sich klinische Studien in der evidenzbasierten Medizin und klinischen Forschung mit der Erhebung von Daten. Sie wird mit Patienten oder gesunden Probanden durchgeführt und ist eine Voraussetzung für die behördliche Arzneimittelzulassung oder Zulassungserweiterung. Ziel klinischer Studien ist es, Arzneimittel, bestimmte Behandlungsformen, medizinische Interventionen oder Medizinprodukte auf ihre Wirksamkeit und Sicherheit zu überprüfen. Klinische Studien werden durchgeführt, um wissenschaftliche Fragestellungen zu beantworten und die medizinische Behandlung zu verbessern.

Leibniz-Institut DSMZ GmbH

Biologische Charakterisierung und Auswahl therapietauglicher Phagen

Damit ein Patient, welcher mit einem multiresistenten Bakterium (bspw. Staphylococcus aureus in Form von MRSA oder 3/4MRGN Pseudomonas aeruginosa) besiedelt/infiziert ist, mit Bakteriophagen (kurz: Phagen) behandelt werden kann, müssen zunächst gut geeignete lytische Phagen identifiziert und bereitgestellt werden. Ein gut geeigneter Phage zeichnet sich dadurch aus, dass er zum einen möglichst viele Bakterienvarianten („Stämme“, „Isolate“) einer Art zerstören kann und zum anderen als unbedenklich eingestuft ist. Dazu werden Phagen aus der Sammlung des Leibniz-Instituts DSMZ GmbH auf einer diversen Sammlung von Patientenisolaten getestet. Zudem müssen diese Phagen genetisch untersucht werden, damit ausgeschlossen werden kann, dass sie Virulenzfaktoren oder Antibiotikaresistenzmarker tragen. Vielversprechende Kandidaten werden nachfolgend in vitro (im Labor) auf die Effizienz Bakterien zu zerstören erforscht. Gleichzeitig erfolgt die Suche nach weiteren neuen Phagen in unterschiedlichen Umweltproben, um das Repertoire zu vergrößern. Es folgt die klonale Vereinzelung/klonale Reinigung der Phagen, Vermehrung in kleinem Maßstab und ebenfalls die Untersuchung auf ihre Eignung für Anwendungszwecke. Da jeder Phage innerhalb einer Bakterienart nur bestimmte Patientenisolate zerstören kann, ist es notwendig verschiedene Phagen zu finden, die gemeinsam möglichst viele Bakterienisolate abdecken. Für jede im Projekt PhagoFlow priorisierte Bakterienart soll daher ein Set an Phagen mit hoher genetischer und morphologischer Diversität zusammengestellt werden, so erhöht sich die Wahrscheinlichkeit ausreichender Abdeckungen von Patientenisolaten.

Im Zuge des Projekts PhagoFlow soll rechtzeitig das Verfahren eines Phagogramms für die Kliniklaborroutine zur Empfindlichkeitsprüfung von Patientenisolaten gegenüber Phagen entwickelt werden. Dazu ist es notwendig verschiedene Methoden miteinander auf Durchführbarkeit, Auswertbarkeit und Reproduzierbarkeit zu vergleichen. Das Ziel ist eine einfache Durchführung und Harmonisierung der Inkubationsbedingungen, damit dieses Verfahren gut in den Routine-Alltag der Diagnostik integriert werden kann.

Zunächst werden für drei Bakterienarten aus der ESKAPE-Gruppe effiziente neue Phagen gesucht: 1.) Staphylococcus aureus (mit sehr hoher Häufigkeit als Infektionserreger im BWkrhs festgestellt) ist ein kugelförmiges gram-positives Bakterium, ein normaler Bewohner der Haut und des Nasen-Rachenraums. Stämme dieser Bakterienart sind jedoch oft befähigt, verschiedene Toxine zu produzieren, ferner ist das Bakterium als Eitererreger bei Entzündungsprozessen bekannt. Gerät das Bakterium in die Blutbahn, so können gravierende Folgen entstehen, es ist einer der häufigsten bekannten Erreger der Bakteriämie und Sepsis, siedelt sich aber auch an Organen wie z. B. an Herzklappen sowie an körperfremden Oberflächen ab wie z. B. an künstlichen Herzklappen oder Gelenkersatz. Bei S. aureus sind die MRSA-Varianten, Methicillin-resistente Stämme, besonders gefürchtet, der sprichwörtliche sogenannte „Krankenhauskeim“, dessen antibiotische Behandlung schwierig ist. 2.) Ebenso ist Pseudomonas aeruginosa ein im BWkrhs sehr häufig festgestellter Infektionserreger, ein gram-negatives Stäbchenbakterium, das quasi überall in der Umwelt und in und auf uns vorkommt, ein überaus flexibles Genom hat und aufgrund dieser Flexibilität der genetischen Ausstattung sehr anpassungsfähig ist. Besonders typisch kommt P. aeruginosa in Biofilmen vor, mikrobielle Lebensgemeinschaften, in denen die Bakterien zwar „ruhen“, aber intensiven Austausch von Genen und Information pflegen (s. auch „Quorum sensing“), bereit, auch Virulenzfaktoren und Antibiotikaresistenzen zum gegenseitigen Selektionsvorteil auszutauschen. Die genannten unerwünschten Eigenschaften von S. aureus treffen fast vollumfänglich auch für P. aeruginosa zu, wobei P. aeruginosa allgemein bei verschiedenen Infektionen noch etwas häufiger ist. Bei dieser Bakterienart sind mittlerweile nicht nur multi- sondern sogar pan-resistente Stämme bekannt, bei denen kein einziges therapietaugliches Antibiotikum mehr anschlägt. 3.) Mit mäßiger Häufigkeit wird im BWkrhs das ebenfalls gram-negative Stäbchen Escherichia coli diagnostiziert, ein typischer Darmbewohner, der innerhalb seiner Art vom Status des wichtigen Mikrobiombewohners bis hin zum lebensgefährlichen Pathotyp EHEC eine gewaltige Breite an Varianten aufweist, mit Stämmen, die weder Toxine bilden noch Virulenzfaktoren tragen bis zu extrem gefährlichen Toxinbildnern mit raffinierten Infektionsmechanismen und Antibiotika-Multiresistenzen. Die Bedeutung der Feindiagnostik im Falle von E. coli bei Patienten ist daher besonders deutlich. Diese drei Bakterienarten haben zudem gemeinsam dass sie sich sehr schnell vermehren. Auch in Mischinfektionen kommen sie vor. Im weiteren Projektverlauf können nach Bedarf und Möglichkeiten weitere Bakterienarten in den Fokus rücken.

Fraunhofer ITEM

Herstellung von Phagen-Wirkstoffen in GMP-Compliance

Im PhagoFlow Projekt werden vom Fraunhofer ITEM eine Vielzahl an Phagen GMP-gerecht hergestellt. Da sich diese Phagen z.B. hinsichtlich ihrer Lysekinetik und biochemischen Eigenschaften unterscheiden können, wird eine standardisierte Herstellungs-Plattform für Phagen-Wirkstoffe entwickelt, die jeweils nur noch Phagen-spezifisch anzupassen ist.

Diese Plattform umfasst standardisierte Kultivierungs- und Reinigungsschritte und soll es ermöglichen, einen einmal etablierten Herstellungsprozess für Phagen als Pharmawirkstoffe durch Feinjustierung von Parametern von einem auf andere Phagen zu übertragen. Nach Erhalt der Phagen und deren jeweiligem Produktionsstamm von der DSMZ werden im Fraunhofer ITEM zunächst Herstellungsprozesse im Labor-Maßstab etabliert. Dazu erfolgt nach der Anzucht der Produktionsstämme eine Infektion mit Phagen, die zu deren Vermehrung bis hin zur vollständigen Lyse des Produktionsstamms führt. Die Aufreinigung der Phagen wird durch bis zu 2 Chromatographie-Schritte und Ultrafiltration soweit optimiert, dass Medienbestandteile und Reste des Produktionsstamms, wie Hostzellproteine und Endotoxine weitestgehend abgetrennt werden.

An die Prozessentwicklung schließt jeweils eine Herstellung der Phagen als pharmazeutische Wirkstoffe in Übereinstimmung zu den Anforderungen des pharmazeutischen Qualitätssicherungssystems GMP an. Dazu wird zunächst für jeden einzelnen Phagen und seinen Produktionsstamm ein Master-Phagenstock bzw. eine Master-Zellbank angelegt, die dann zur Erstproduktion wie auch zur späteren Nachproduktion des Phagen-Wirkstoffs dient. Die zuvor im Labor entwickelte Herstellungssequenz wird abhängig von der Konzentration der Phagen im Kulturüberstand, deren Ausbeute nach der Aufreinigung, deren Stabilität und dem klinischen Verbrauch hochskaliert und durchgeführt. Jeder Phagen-Wirkstoff wird nach der Herstellung in Aliquots abgefüllt, auf u.a. Gehalt, Identität, biologische Aktivität (potency) und Reinheit geprüft und final über ein Analysen- (CoA) und ein Qualitätszertifikat (CoC) zur Weiterverarbeitung zu magistralen Zubereitungen durch Klinik-Apotheken freigegeben.